Nel 1936, l'archeologo americano Indiana Jones guida una spedizione per recuperare un idolo d'oro da un tempio peruviano con trappole mortali. Quando sembra avere successo, la guida locale Satipo tradisce Jones per rubargli l'idolo, finendo poi ucciso da una trappola, e solo Jones riesce ad uscire vivo, con l'idolo, dal tempio pericolante. L'archeologo rivale René Belloq lo mette alle strette e gli ruba l'idolo. Inseguito dai pericolosi indios Hovitos, alleati dello stesso Belloq, Jones fugge a bordo di un idrovolante.

Dopo essere tornato alla sua università, Jones, insieme al collega e amico Marcus Brody, viene informato da due agenti dei servizi segreti statunitensi che i nazisti stanno scavando a Tanis, in Egitto, e uno dei loro telegrammi menziona il vecchio mentore di Jones, Abner Ravenwood. Jones deduce che i nazisti cerchino la mitica Arca dell'Alleanza, nascosta in una camera segreta della città, che, secondo loro, li renderà invincibili. Per trovarla devono mettere le mani sull'amuleto dell'asta di Ra, custodito da Abner, che può indicare dove si trova la camera attraverso un modello in scala della città. Gli agenti quindi reclutano Jones per recuperare l'arca prima che ci riescano i nazisti.

In un bar del Nepal, Jones si riunisce con la figlia di Abner, Marion Ravenwood, con la quale Jones ha avuto una relazione illecita, e scopre che Abner è morto. In seguito il bar viene incendiato durante una colluttazione con un gruppo di nazisti, capeggiati dal sinistro agente della Gestapo Arnold Toht, intento a prendere il medaglione da Marion. Toht tenta di recuperarlo dalle fiamme, ma gli brucia solo l'immagine nella mano, mentre Jones e Marion uccidono i nemici restanti e recuperano il medaglione.

Giunti a Il Cairo, scoprono dall'amico Sallah che Belloq, ora collega dei nazisti comandati dal Colonnello Herman Dietrich, ha modellato una replica del medaglione incompleta dalle ustioni della mano di Toht. Al mercato, soldati e mercenari nazisti attaccano Jones e Marion viene poi rapita e solo apparentemente uccisa, nell'esplosione di un camion. Uno scoraggiato Jones crede che Marion sia morta, ma invece è prigioniera dei nazisti e di Belloq.

Nel frattempo, un imam decifra il medaglione per Jones, rivelando che su un lato è scritto un avvertimento contro il disturbo dell'Arca, e sull'altro sono scritte le misure corrette per il bastone di Ra. A questo punto, Jones e Sallah si rendono conto che i nazisti stanno scavando nella posizione sbagliata. Il mattino dopo Jones si infiltra negli scavi in corso, e usa il medaglione e il bastone delle dimensioni corrette per scoprire dove è il Pozzo delle Anime, il luogo di riposo dell'Arca. Una volta trovata l'entrata, il Pozzo si rivela anche essere pieno di serpenti velenosi e mummie. Mentre Belloq flirta con Marion, la ragazza lo sfida in una gara di bevute e, fingendosi ubriaca, tenta di scappare. Tuttavia, Toht le impedisce la fuga e cerca di interrogarla, ma invano. Jones e Sallah recuperano l'Arca, ma Belloq e i nazisti li scoprono e la sequestrano, e Toht getta Marion nel Pozzo su richiesta di Dietrich e contro la volontà di Belloq. Rinchiusi all'interno del Pozzo, Jones e Marion riescono a trovare una via d'uscita e scappare prima che l'Arca venga trasportata via con un aereo, distruggendolo e costringendo i nazisti a ricorrere a un camion. Dopo un estenuante inseguimento nel deserto, Jones riesce a rubare il camion.

Insieme a Marion, Jones organizza il trasporto dell'Arca a Londra a bordo di un piroscafo capitanato da Katanga, un amico di Sallah. Il giorno dopo un sottomarino tedesco intercetta il piroscafo e i nazisti sequestrano l'Arca e Marion, mentre Jones si nasconde e Katanga, per salvarlo, dice di averlo ucciso. Jones si imbarca di nascosto sull'U-Boot, che si dirige verso un'isola nel Mar Egeo, dove Belloq intende compiere un rituale ebraico per controllare se l'Arca contiene i resti delle Tavole della Legge.

Sull'isola, Jones sorprende il gruppo nazista minacciando di distruggere l'Arca pur di liberare Marion, ma si arrende quando Belloq non cede al bluff, conoscendo la sua curiosità da archeologo. Jones e Marion vengono legati a un palo mentre Belloq fa aprire cerimonialmente l'Arca, ma trova solo sabbia all'interno. Improvvisamente, l'Arca libera una forza ultraterrena che guasta le apparecchiature naziste, e Jones e Marion chiudono gli occhi per non guardare. L'Arca rilascia spiriti, fiamme e lampi di energia che uccidono Belloq, Toht e i nazisti, e il fuoco divino li risucchia aprendo il cielo e l'Arca si chiude. Tornata la calma sull'isola, Jones e Marion aprono gli occhi e si ritrovano liberi dalle corde.

Tornato a Washington con Marion, Jones viene premiato ma è furibondo per come il governo neghi loro l'Arca e la possibilità di studiarla. Gli agenti affermano che l'Arca è stata spostata in un luogo segreto affinché i loro "uomini qualificati" possano studiarla. In realtà, l'Arca viene conservata tra innumerevoli altre casse di un grande deposito contenente materiale top secret.

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